Mutacja aktywująca GPR54 u pacjenta z centralnym przedwczesnym okresem dojrzewania czesc 4

W oddzielnym eksperymencie komórki stymulowano 10-9 M kisspeptyny-10 przez 0, 2, 4 lub 18 godzin; otrzymane poziomy fosforanu inozytolu wyrażono jako procent maksymalnego poziomu (po 2 godzinach) (panel B). Każdy punkt jest średnią z pięciu niezależnych eksperymentów, każdy wykonany w dwóch lub trzech egzemplarzach. Na koniec komórki transfekowano 50 ng GPR54 typu dzikiego, 50 ng tylko Arg386Pro GPR54 lub 25 ng GPR54 typu dzikiego i 25 ng Arg386Pro GPR54. Całkowitą akumulację fosforanu inozytolu mierzono po stymulacji 10-8 M kisspeptyny-10 przez 0, 1, 2 lub 4 godziny (panel C). I słupki reprezentują standardowe błędy. Podstawowe poziomy fosforanu inozytolu nie różniły się istotnie w komórkach COS-7 transfekowanych GPR54 typu dzikiego i transfekowanych Arg386Pro GPR54. Ponadto, nie było znaczącej różnicy w krzywych dawka-odpowiedź lub w maksymalnych odpowiedziach GPR54 typu dzikiego i Arg386Pro GPR54 na zwiększenie stężenia kisspeptyny (10-11 do 10-7 M kisspeptyny-10) (Figura 2A) . Stężenie kisspeptyny, które wywołało odpowiedź w połowie między wyjściową a maksymalną odpowiedzią, wynosiło 0,23 nM dla GPR54 dzikiego typu i 0,28 dla Arg386Pro GPR54, a maksymalna aktywność fosforanu inozytolu wynosiła odpowiednio 78,4 i 77,8 zliczeń na minutę na mikrogram białka. Jednakże, badanie przebiegu w czasie wykazało, że poziom fosforanu inozytolu osiąga maksimum w 2 godziny zarówno dla typu dzikiego, jak i Arg386Pro GPR54, ale szybkość spadku poziomów fosforanu inozytolu była wolniejsza w komórkach transfekowanych Arg386Pro GPR54, co skutkowało znacznie wyższym inozytolem. poziomy fosforanów po 18 godzinach stymulacji kisspeptyną (Figura 2B). Efekt ten był również widoczny, gdy zarówno dziki typu i Arg386Pro GPR54 zostały transfekowane do komórek COS-7 (Figura 2C).
Figura 3. Figura 3. Przebieg czasowy stymulacji kisspeptyną fosforylacją pozakomórkowej regulowanej kinazą sygnałową (ERK) w komórkach COS-7 transfekowanych GPR54 typu dzikiego lub Arg386Pro GPR54. Fosforylowane poziomy ERK (pERK) mierzono za pomocą analizy Western-blot po stymulacji 3 x 10-9 M kisspeptyny-10 przez 0, 5, 10, 15, 30 lub 60 minut. Panel A pokazuje reprezentatywne bloty Western. Intensywność pasm pERK znormalizowano do całkowitej liczby pasm ERK. Panel B pokazuje stosunek pERK do całkowitego ERK, wyrażony jako procent maksymalnego poziomu (po 10 minutach). Każdy punkt jest średnią z pięciu niezależnych eksperymentów; I słupki reprezentują standardowe błędy.
W celu potwierdzenia tego przedłużonego przebiegu działania związanego ze zmutowanym receptorem, mierzono przebieg czasowy fosforylacji pozakomórkowej regulowanej sygnałem kinazy, kolejnego końcowego efektora kaskady sygnalizacyjnej GPR54, w odpowiedzi na kisspeptynę. Poziom fosforylowanej pozakomórkowej kinazy regulowanej sygnałem we wszystkich komórkach osiągnął maksimum 10 minut, po czym poziomy spadły. Szybkość obniżania fosforylowanych pozakomórkowych poziomów kinazy regulowanej sygnałem była wolniejsza w komórkach transfekowanych GPR54 Arg386Pro niż w tych transfekowanych GPR54 typu dzikiego, tak że poziomy w komórkach transfekowanych Arg386Pro GPR54 pozostawały znacząco wyższe po 60 minutach ekspozycji na kisspeptyna (Ryc. 3)
[hasła pokrewne: kamagra bez recepty, zespół dravet, olej ryżowy w kosmetyce ]

Powiązane tematy z artykułem: kamagra bez recepty olej ryżowy w kosmetyce zespół dravet